Hôn nhân của Carlos và em gái họ Isabella được đề xuất bởi quốc hội của hai nước Castilla và Aragon. Carlos đã đồng ý cưới Công chúa Isabella hoàn toàn với lý do chính trị[2]. Đầu năm 1526, bà đi tới Seville, nơi đám cưới diễn ra vào ngày 10 tháng 3 tại Cung điện Alcázar của Sevilla[3][4] .

Isabella về nhà chồng với một tài sản hồi môn rất lớn và đã giúp đỡ được rất nhiều cho tài chính Tây Ban Nha bấy giờ. Mặc dù được biết đến là bắt đầu một liên minh chính trị, cuộc hôn nhân của bà không chỉ có thế mà còn là bởi một tình yêu thật sự. Những ghi chép cho thấy vào tuần trăng mật của họ "khi [Carlos và Isabella] được ở cùng nhau, mặc dù có rất nhiều người xung quanh, họ không nhận thấy bất cứ ai khác, họ nói chuyện và cười thản nhiên, và không có gì khác quấy rối họ". Isabella cũng chứng tỏ rằng mình là một chính trị gia thông minh.

Isabella qua đời tháng 5 năm 1539, khi bà sinh non thai thứ 6[5]. Hoàng đế Karl V lúc đó không có mặt tại cung điện, và cái chết sớm của vợ đã ảnh hưởng sâu sắc đến ông. Sau khi Isabella qua đời, ông không bao giờ tái hôn, và luôn mặc đồ đen trong cuộc đời còn lại của mình.